El núcleo xifoides del tálamo de la línea media controla el frío

Naturaleza (2023)Cita este artículo

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Mantener la temperatura corporal es caro desde el punto de vista calórico para los animales endotérmicos1. Los mamíferos comen más cuando hace frío para compensar el gasto de energía2, pero el mecanismo neuronal subyacente a este acoplamiento no se comprende bien. A través de análisis metabólicos y de comportamiento, descubrimos que los ratones cambian dinámicamente entre estados de conservación de energía y de búsqueda de alimentos en el frío, el último de los cuales está impulsado principalmente por el gasto de energía más que por la sensación de frío. Para identificar los mecanismos neuronales que subyacen a la búsqueda de alimentos inducida por el frío, utilizamos el mapeo de c-Fos de todo el cerebro y descubrimos que el xifoides (Xi), un pequeño núcleo en el tálamo de la línea media, se activaba selectivamente por el frío prolongado asociado con un gasto energético elevado, pero no con exposición aguda al frío. Las imágenes de calcio in vivo mostraron que la actividad de Xi se correlaciona con episodios de búsqueda de alimento en condiciones de frío. Utilizando estrategias virales dependientes de la actividad, encontramos que la estimulación optogenética y quimiogenética de las neuronas Xi activadas por el frío recapituló selectivamente la búsqueda de alimentos en condiciones de frío, mientras que su inhibición la suprimió. Mecánicamente, Xi codifica un cambio de valencia dependiente del contexto que promueve conductas de búsqueda de alimento en condiciones frías pero no cálidas. Además, estos comportamientos están mediados por una proyección de Xi al núcleo accumbens. Nuestros resultados establecen a Xi como una región clave en el control de la alimentación inducida por el frío, que es un mecanismo importante en el mantenimiento de la homeostasis energética en animales endotérmicos.

La aparición de la endotermia trajo numerosas ventajas adaptativas durante la evolución; sin embargo, también vino acompañado de un aumento significativo del gasto energético. Para alimentar esta mayor demanda de energía, los mamíferos adaptan drásticamente su comportamiento de búsqueda de alimento en respuesta a los cambios de temperatura y existe una asociación estrecha e inextricable entre la temperatura ambiente y la ingesta de alimentos: cuanto más frío es el ambiente, más alimentos se necesitan para mantener la temperatura corporal central1,2 ,3. Se sabe que los mamíferos, incluidos los humanos, comen más cuando hace frío. Varios festivales en diferentes culturas que involucran fastuosas fiestas durante el invierno son un testimonio de nuestro pasado evolutivo endotérmico4,5,6. Sin embargo, la base neuronal que vincula las necesidades energéticas derivadas del frío y el aumento de la alimentación siguen siendo preguntas sin respuesta en nuestra comprensión de la biología de los mamíferos.

Los roedores son un excelente modelo para estudiar esta asociación entre temperatura y consumo energético7. Por ejemplo, los ratones de laboratorio (Mus musculus) pueden duplicar su ingesta diaria de alimentos cuando viven a 4 °C, y la termogénesis contribuye a alrededor del 60 % del gasto energético de todo el cuerpo en estas condiciones8. Aunque se ha demostrado que la sensación de frío influye de manera aguda en la alimentación a través de centros somatosensoriales y de alimentación conservados en el cerebro tanto en ectotermos como en endotermos9,10,11,12,13, aún no está claro si (o cómo) el gasto de energía inducido por el frío se compensa con los alimentos. consumo. Aquí combinamos análisis metabólicos y de comportamiento de alta resolución para demostrar que el aumento de la alimentación en el frío es una consecuencia del gasto de energía; Además, identificamos el núcleo talámico xifoides de la línea media (Xi) como un centro clave que media el aumento compensatorio en los comportamientos de búsqueda de alimentos.

Se ha informado que alojar ratones a 4 °C conduce a una termogénesis, un gasto de energía y una ingesta de alimentos elevados8,14. Para obtener una visión más detallada del gasto energético, utilizamos calorimetría indirecta para determinar el gasto energético de un ratón individual en tiempo real mediante la medición de los intercambios de oxígeno y dióxido de carbono15. La calorimetría indirecta resuelta temporalmente mostró que cambiar la temperatura ambiente de 23 a 4 ° C aumentó inmediatamente el gasto de energía (Fig. 1a, by Datos ampliados Fig. 1a-f). Sin embargo, hubo una disminución inicial y un retraso sustancial entre la caída de temperatura y el aumento de la ingesta de alimentos (Fig. 1b), lo que sugiere que la sensación rápida de frío podría no ser la causa directa de la alimentación inducida por el frío. Tras la cuantificación de la asociación temporal entre el gasto de energía y la alimentación, encontramos que, a medida que avanzaba la exposición al frío, la ingesta de alimentos se correlacionaba más con el gasto de energía (comenzando a las 5 a 6 h después de la exposición al frío y permaneciendo elevada a partir de entonces; Fig. 1c). Sobre la base de esta correlación progresiva, definimos este período de 5 a 6 h después de la exposición al frío como el inicio de la compensación de energía inducida por el frío (CIEC) y nos centramos en esta ventana de tiempo durante el resto del estudio, incluida la grabación de vídeo. de ratones dentro de este período para comprender mejor estos comportamientos.

a, Progresión de noventa horas del gasto energético (EE) y la ingesta de alimentos (n = 24 ratones). En verde se representa el gasto energético y en negro la ingesta de alimentos; las líneas y el sombreado denotan la media y el sem, respectivamente, de cada grupo. b, Vista ampliada de a durante el cambio de 23 a 4 °C. c, Diagrama de dispersión que representa la relación entre el gasto de energía y la alimentación durante un período de 11 h después del cambio de temperatura (durante el ciclo de luz, n = 24 ratones). Cada punto representa el gasto energético promedio y la ingesta de alimentos en todos los ratones en cada hora. Las puntas de flecha indican el período de transición clave (entre 5 y 6 h) después del inicio de las condiciones frías. d – f, Análisis del comportamiento de animales sometidos a CIEC utilizando un HMM. Definimos un HMM de tres estados: (1) conservación de energía; (2) exploración con alimentación; y (3) exploración sin alimentación. Generamos la matriz de transición estimada inicial asumiendo probabilidades iguales para todas las transiciones porque no teníamos información a priori. d, Eventos de comportamiento representativos evaluados para un ratón macho C57BL/6J después de estar en condiciones de frío durante 5 h. e, Representación del HMM de la alimentación asociada a CIEC (n = 3 ratones). f, Porcentaje de tiempo pasado en cada estado de HMM. g, vista ampliada de una sesión de 10 minutos de e, que muestra la asignación de estado de HMM. h, Esquemas de limpieza de todo el cerebro e imágenes tridimensionales volumétricas utilizadas para identificar regiones del cerebro activadas durante CIEC. i, resultados del mapeo de c-Fos para el tálamo. Cada punto representa el recuento de células c-Fos+ en cada región distinta según el registro de Allen Brain Atlas; El tamaño del punto representa la diferencia en la densidad de la señal entre las dos condiciones. Las estructuras activadas bajo temperatura termoneutral están sombreadas en naranja y las activadas bajo condiciones frías en azul.

Curiosamente, a pesar del aumento general en la ingesta de alimentos cuando experimentaban frío, la mayoría de los ratones permanecieron inmóviles en lugar de participar activamente en la búsqueda de alimento (Fig. 1d). Esta observación sugirió que, en lugar de un aumento unilateral del apetito, los ratones enfrentaban prioridades en competencia entre conservar energía para la termogénesis (permaneciendo inmóviles) versus reponer el suministro de energía (buscando alimento). Sin embargo, los ratones también participaron en diversos comportamientos termorreguladores distintos de la alimentación en condiciones de frío, como la recuperación y disposición de la ropa de cama (Fig. 1d). Para comprender mejor las relaciones entre estos comportamientos, primero los anotamos en 15 acciones específicas y utilizamos un modelo oculto de Markov (HMM) no supervisado para identificar tres estados distintos mostrados por los ratones: estado 1, un estado de conservación de energía en el que estaban en su mayoría inmóvil; estado 2, una exploración con estado de búsqueda de alimento con mayor probabilidad de comer; y el estado 3, una exploración sin estado de búsqueda de alimento, donde los ratones realizaron otras acciones sin consumir alimentos (Fig. 1d – g y Datos ampliados Fig. 2a – c). Este análisis nos permitió utilizar solo tres estados de HMM, en lugar de las 15 acciones específicas, para estudiar selectivamente el estado de alimentación inducido por CIEC (estado 2). Debido a que el estado 1 es el estado predominante (Fig. 1f), nos centramos en la caracterización de las transiciones de estado salientes desde el estado 1 para todos los análisis posteriores.

Para identificar los mecanismos del circuito que subyacen a la alimentación inducida por CIEC, primero realizamos una prueba de c-Fos en todo el cerebro16,17 en ratones que se habían mantenido a 4 o 30 °C (termoneutralidad murina, para maximizar las diferencias de actividad en todo el cerebro). durante 6 h, utilizando SHIELD de todo el cerebro (estabilización en condiciones duras mediante enlaces epóxido intramoleculares para evitar la degradación), etiquetado por inmunofluorescencia, imágenes con láminas de luz y análisis automatizado (Fig. 1h y Tabla complementaria 1) 18,19,20. Las condiciones de frío provocaron una amplia disminución de la señal de c-Fos en la corteza, probablemente debido a la disminución general de la actividad física de estos animales (Datos ampliados, figuras 3a a c). El hipotálamo, donde se centra la termorregulación21, mostró una fuerte activación de c-Fos como se esperaba (Datos ampliados, Fig. 3a, d). Sorprendentemente, mientras que la mayor parte del tálamo se suprimió en condiciones de frío, varias regiones talámicas de la línea media ventral (vMT) mostraron una mayor activación (Fig. 1i). Decidimos explorar más a fondo esta área por dos razones. En primer lugar, en el hámster siberiano (un modelo de adaptación al frío), se ha informado que las lesiones en el vMT perjudican la adaptación al frío en invierno22. En segundo lugar, recientemente se demostró en ratones que el vMT es un centro crucial para determinar cómo los estados internos se traducen en respuestas de comportamiento opuestas (por ejemplo, congelarse versus luchar) ante amenazas percibidas21, un escenario que se asemeja a las prioridades en competencia entre conservación de energía y comportamientos de búsqueda de alimentos que observamos en CIEC.

A continuación, para diferenciar si la activación de vMT se produjo debido a la sensación de frío o estaba relacionada con CIEC, examinamos la expresión de c-Fos después de 5 h (para modelar CIEC) o 15 minutos (para modelar la sensación aguda) de exposición al frío (Fig. 2a). . Ambas condiciones indujeron c-Fos en el núcleo preóptico mediano, una región clave para la termorregulación (Datos ampliados, figura 4b). Sin embargo, tan solo 5 h de exposición al frío provocaron la activación de c-Fos en el Xi en comparación con 15 minutos de exposición al frío o alojamiento a 30 °C; esta activación no se observó en el núcleo vecino reuniens (Fig. 2b, cy Datos ampliados Fig. 4a). Siguiendo nuestra designación del período de 5 a 6 h posterior a la exposición al frío como el inicio de CIEC (Fig. 1c), definimos estas neuronas c-Fos+ Xi como la población XiCIEC, cuya activación probablemente se debe a CIEC en lugar de a una enfermedad aguda. sensación de frío. Esta activación selectiva de Xi también se observó después de un período prolongado de frío (7 días) (Datos ampliados, figura 4c). Además, tanto los ratones machos como las hembras mostraron activación de Xi durante CIEC (Datos ampliados, figura 4d).

a, Esquema que muestra diferentes paradigmas de exposición al frío utilizados para etiquetar la expresión de c-Fos. b, neuronas c-Fos+ (verde) en el vMT para cada condición que se muestra en a. Los cuadros con borde amarillo muestran imágenes ampliadas de la región de Xi. Barras de escala, 200 μm. CM, núcleo medial central; IAM, núcleo intrantereomedial; Re, núcleo reuniens. c, Cuantificación de células c-Fos+ en cada condición (n = 14 secciones de cuatro ratones para cada condición). Los datos son media ± sem ****P < 0,0001; NS, no significativo utilizando el análisis de varianza unidireccional ordinario (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Dunnett. d, Esquema de la configuración de fotometría de fibra para grabar desde el Xi. e, Imagen representativa de neuronas Xi marcadas con GCaMP6m. Barra de escala, 500 μm. f,g, señal de fotometría de fibra de neuronas vMT/Xi que expresan AAV-GCaMP6m en condiciones frías (f) y termoneutrales (g), mostrada como el promedio de 18 eventos de cuatro ratones diferentes. La línea continua representa el promedio y el área sombreada el sem; La línea discontinua roja representa el inicio de la alimentación. Los recuadros muestran un ejemplo de un solo rastro. h,i, Gráficos de barras del área bajo la curva (AUC) dF/F (−20 a 10 s) (h) y porcentaje máximo de dF/F (i) para datos de fotometría de fibra en f y g, respectivamente. j, señal de fotometría de fibra alineada con la transición del estado 1–2 (línea discontinua roja) basada en HMM, promediada a partir de 11 eventos de tres ratones diferentes; La línea sólida representa el promedio y el área sombreada es sem. El recuadro muestra un ejemplo de un trazo único. k,l, Gráficos de barras de AUC (−10 a 10 s) (k) y pico dF/F (l) cuantificados a partir de j y datos ampliados Fig. 4. Los datos son media ± sem ***P = 0,004 para AUC ( h), ****P < 0,0001 para el pico dF/F (i), **P = 0,0017 para AUC (k) y **P = 0,0024 para el pico dF/F (l) utilizando datos no apareados de dos colas prueba t. au, unidades arbitrarias.

Para determinar cómo la actividad de Xi representa diferentes componentes de comportamiento inducidos por condiciones de frío en tiempo real, utilizamos fotometría de fibra para registrar la dinámica del calcio in vivo de Xi (Fig. 2d, e). De acuerdo con los resultados de c-Fos (Fig. 2b, c), encontramos que una disminución aguda de la temperatura (23 a 4 ° C) no condujo a la activación del Xi (Datos ampliados, Fig. 4e). A continuación, analizamos la dinámica del calcio Xi durante la búsqueda de alimentos asociada a CIEC. Los ratones que se movían libremente se colocaron en condiciones frías con comida y agua durante 5 h antes del registro de la fotometría de fibra. Hubo un marcado aumento en la actividad de Xi antes de cada evento de alimentación en condiciones de frío, pero esto no se observó en los episodios de alimentación a temperatura termoneutral (no CIEC) en los mismos individuos (Fig. 2f-i), lo que sugiere que la actividad de Xi fue selectiva. asociado con la alimentación inducida por CIEC. Para obtener información adicional sobre la actividad de Xi inducida por el frío, creamos un escenario con un déficit de energía inducido por el frío exacerbado (CIEC+) al restringir brevemente el acceso a los alimentos durante las primeras 3 h de exposición al frío. En condiciones de CIEC +, observamos transitorios de calcio Xi más elevados dentro de los mismos animales, lo que sugiere que la actividad de Xi era escalable con CIEC (Datos ampliados, figuras 4f-h). Además, las neuronas Xi no respondieron a la alimentación canónica inducida por el ayuno ni a temperatura ambiente ni a 30 °C (datos ampliados, figuras 4j-l), lo que sugiere que su actividad está específicamente asociada con CIEC pero no con un déficit energético general asociado con restricción de alimentos. Los niveles plasmáticos de glucosa y leptina, que normalmente disminuyen con el ayuno, no se alteraron durante la CIEC (Datos ampliados, figuras 1j y 5a, b), mientras que hubo niveles elevados de productos de lipólisis (Datos ampliados, figuras 5c a f), lo que sugiere que no Las vías canónicas están señalando el estado CIEC al cerebro, aunque la naturaleza molecular exacta de dicha vía aún está por determinar.

Mediante una mayor incorporación de los estados de HMM en el análisis de fotometría de fibra, descubrimos que la actividad Xi está fuertemente asociada con la transición entre el estado de conservación de energía (estado 1) y el estado de búsqueda de alimentos (estado 2), pero no con la transición entre el estado 1 y el estado. Estado exploratorio 3 sin búsqueda de alimentos (Fig. 2j-l y Datos ampliados Fig. 4i), lo que sugiere que la actividad Xi no está asociada con movimientos exploratorios generales. En conjunto, estos resultados indican que las neuronas Xi se activan específicamente durante la transición entre los estados 1 y 2, lo que lleva a una alimentación compensatoria de una manera que aumenta con una amplitud creciente a mayor CIEC.

La relación temporal entre la actividad de Xi y la búsqueda de alimentos inducida por CIEC nos llevó a preguntarnos si las neuronas Xi podrían modular causalmente este comportamiento. Sin embargo, el Xi es un núcleo talámico de línea media pequeño y menos estudiado, sin límites ni marcadores moleculares bien definidos23,24. Al observar que CIEC indujo selectivamente c-Fos en Xi sin activar las áreas circundantes (Fig. 2b), planteamos la hipótesis de que podríamos apuntar a estas neuronas XiCIEC en función de su historial de activación único durante exposiciones previas a condiciones de frío. Aprovechando una estrategia vCAPTURE previamente validada17,25,26,27,28 basada en ESARE-ER-Cre-ER29 dependiente de la actividad, nos dirigimos a las neuronas Xi activadas en frío con un hM3Dq (receptor de diseño muscarínico humano M3 acoplado a Gq activado exclusivamente por un fármaco de diseño (DREADD) o un control de proteína fluorescente roja (RFP); Fig. 3a-c). De acuerdo con la especificidad y eficiencia del trabajo previo de CAPTURE y recombinación dirigida en poblaciones activas25,27,29, encontramos que las neuronas XiCIEC fueron capturadas eficientemente a 4 °C y que estas neuronas se superpusieron altamente con las neuronas c-Fos+ inducidas por el frío (89,9 ± 6,7% por c-Fos/CAPTURE, 52,6 ± 12,4% por CAPTURE/c-Fos), mientras que se capturaron neuronas mínimas a 30 °C (Figs. 3a, d-f y 2a, b).

a, Esquema que muestra el sitio de inyección para AAV-eSARE-ER-Cre-ER y AAV-DIO-hM3Dq o control RFP en Xi. b, Esquemas de la estrategia de etiquetado dependiente de la actividad de vCAPTURE utilizada para expresar hM3Dq DREADD en neuronas Xi activadas por CIEC. c, Esquemas que muestran procedimientos para la captura dependiente de la actividad de neuronas CIEC frente a neuronas no CIEC en el Xi. Para vCAPTURE de neuronas XiCIEC, se administró tamoxifeno a ratones 5 h después de la exposición a condiciones de frío (4 ° C). TA, temperatura ambiente. d, Histología representativa de ratones no CIEC (30 °C, arriba) y CIEC (4 °C, abajo) utilizados para el doble marcaje de c-Fos. Izquierda: etiquetado hM3Dq mediado por vCAPTURE en la región vMT/Xi; centro: etiquetado de c-Fos activado por CIEC; derecha: superposición del doble etiquetado de vCAPTURE y c-Fos. Barras de escala, 500 μm e,f, Cuantificación del doble marcaje de c-Fos con neuronas vCAPTURE en Xi (16 secciones de n = 4 ratones). Números totales de Gq capturados (e) y se superponen con c-Fos a 4 ° C (f). Los datos son media ± sem ****P < 0,0001 utilizando la prueba t no apareada de dos colas. g, Gráfico de barras que muestra los niveles de ingesta de alimentos después de la activación de las neuronas XiCIEC versus Xinon-CIEC en comparación con los controles RFP (n = 5 ratones por grupo). Los datos son media ± sem *P = 0,0397 y NS = 0,7374 utilizando ANOVA unidireccional ordinario con corrección de Dunnett para comparaciones múltiples. h,i, Esquemas de la estrategia vCAPTURE (h) y el procedimiento (i) utilizados para probar el experimento de pérdida de función con DREADD-Gi(hM4Di). Tenga en cuenta que a los ratones en este experimento se les restringió brevemente la comida (indicada por barras grises) antes de la inyección de CNO, para elevar la alimentación inicial. YFP, proteína fluorescente amarilla. j, Gráfico de barras que muestra los niveles de ingesta de alimentos después de la inhibición de las neuronas XiCIEC (n = 4 ratones para RFP y n = 4 para Gi). Los datos son media ± sem ***P = 0,0003 utilizando la prueba t no apareada de dos colas. 4-TM, 4-hidroxitamoxifeno.

Después de la reactivación con N-óxido de clozapina (CNO), observamos un aumento significativo en la ingesta de alimentos en ratones tratados con hM3Dq en condiciones de frío (XiCIEC) en comparación con aquellos tratados con el control RFP o a 30 °C (Xinon-CIEC) (Fig. 3g ). Luego utilizamos la misma estrategia vCAPTURE para apuntar a las neuronas XiCIEC con un hM4Di DREADD inhibidor. Se observó una disminución significativa en la ingesta de alimentos inducida por CIEC después de la inhibición mediada por CNO en comparación con el control de RFP (Fig. 3h-j y Datos ampliados Fig. 6a). Por el contrario, ni la inhibición ni la activación quimiogenética afectaron la ingesta de alimentos a temperatura ambiente (Datos ampliados, Fig. 6b, c), lo que indica además que el papel de las neuronas Xi es específico de la alimentación inducida por el frío.

Para comprender cómo las neuronas XiCIEC promueven la alimentación con una resolución temporal más alta, recurrimos a la optogenética. Primero inyectamos AAV que expresa ChR2 directamente en la región vMT y analizamos los comportamientos alimentarios en un escenario CIEC (Datos ampliados, Fig. 7a, b). La estimulación optogenética de la región vMT en masa condujo a una mayor ingesta de alimentos, pero también provocó un rápido aumento en el movimiento general que no se observó durante la adaptación natural a las condiciones de frío (Datos ampliados, figuras 7c a f). Estos resultados sugirieron que la activación no específica de neuronas vecinas fuera del Xi puede haber confundido el comportamiento.

Para mejorar la especificidad, utilizamos nuevamente el sistema vCAPTURE dependiente de la actividad para expresar selectivamente ChR2 en neuronas XiCIEC (Fig. 4a, b). La fotoestimulación de las neuronas XiCIEC que expresan ChR2 dio como resultado un fuerte aumento en la ingesta de alimentos sin cambios en el movimiento general (Fig. 4c-f) o en una prueba de campo abierto (Datos ampliados, Fig. 8a-d) en comparación con los controles de RFP. Curiosamente, en ausencia de frío (es decir, con termoneutralidad de roedores, 30 °C), la fotoestimulación de las neuronas XiCIEC resultó en solo un cambio menor, pero no significativo, en la ingesta de alimentos (Datos ampliados, Fig. 8e-h), lo que indica que las neuronas XiCIEC requieren un estado CIEC para inducir una alimentación genuina en animales. Además, el análisis de video mostró que la fotoactivación de XiCIEC resultó en más transiciones del estado 1 de HMM de conservación de energía al estado 2 de búsqueda de alimentos, mientras que las transiciones de los estados 1 a 3 no se alteraron (Fig. 4g, h). De manera similar, el tiempo total pasado en el estado 2 aumentó después de la fotoestimulación (Fig. 4i y Datos ampliados Fig. 8i). Estos resultados, en combinación con los datos anteriores de fotometría de fibra, indican que la actividad XiCIEC promueve específicamente la alimentación inducida por CIEC sin afectar otras acciones generales relacionadas con el movimiento.

a, Esquema de inyección viral, colocación de fibras e imágenes histológicas representativas. Barra de escala, 500 μm. b, Esquema que muestra los procedimientos experimentales optogenéticos de vCAPTURE. Estim., estimulación. c, d, Diferencia en la ingesta de alimentos en condiciones de frío para ratones ChR2 (n = 9 ratones, n = 18 veces) (c) y para ratones control RFP (n = 7 ratones, n = 13 veces) (d). e, f, diferencia en la actividad física en condiciones de frío para ratones ChR2 (n = 9 ratones, n = 18 veces) (e) y para ratones control RFP (n = 7 ratones, n = 9 veces) (f). Los datos son media ± sem ****P < 0,0001 (c), NS = 0,6953 (d), NS = 0,6287 (e) y NS = 0,7252 (f) utilizando la prueba t pareada de dos colas. g, Número total de transiciones del estado 1 (estado de ahorro de energía) al estado 2 (exploración con alimentación) en ratones ChR2 (n = 7 ratones). h, transición de estado del estado 1 al estado 3 (exploración sin alimentación). i, Tiempo total pasado en diferentes estados (n = 7 ratones). Los datos son media ± sem ***P = 0,0005 (g), NS = 0,8779 (h), ***P = 0,0006 (i, izquierda) y **P = 0,0046 (i, derecha) utilizando métodos pareados de dos colas. prueba t. j–m, prueba RTPP. j,k, mapas de calor representativos de un ratón ChR2 (j) y control RFP (k). l, Cuantificación del porcentaje de tiempo empleado en el lado estimulado. Los datos son media ± sem ****P < 0,0001 para ChR2 inicial versus ChR2 4 °C y ChR2 RT versus ChR2 4 °C; NS = 0,4589 para el valor inicial de ChR2 versus RT de ChR2; NS = 0,7083, 0,9985 y 0,9648 para RFP inicial frente a RT, 4 °C y RFP RT frente a 4 °C, respectivamente, utilizando ANOVA ordinario de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey (n = 11 para ChR2 y n = 6 para control RFP ). m, cambio porcentual en la preferencia entre el tiempo pasado en la cámara de estimulación, normalizado al nivel basal sin láser (n = 11 para ChR2 y n = 6 para el control RFP). Los datos son media ± sem ****P < 0,0001 para ChR2 RT frente a ChR2 4 °C, NS = 0,6887 para RFP RT frente a RFP 4 °C utilizando ANOVA ordinario de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey.

A continuación, para delinear cómo las neuronas Xi afectan las transiciones de comportamiento, utilizamos la preferencia de lugar en tiempo real (RTPP) para determinar la valencia asociada con la activación de Xi. Los ratones que expresan XiCIEC ChR2 se colocaron primero en una arena de dos cámaras sin estimulación láser para determinar una preferencia de lugar basal. Durante RTPP, las neuronas XiCIEC fueron estimuladas cuando los ratones ingresaron a un lado de la arena y esto se detuvo cuando cruzaron al otro lado (Fig. 4j, k). A temperatura ambiente, la activación de XiCIEC no cambió la preferencia de lugar. Sin embargo, cuando se realizó RTPP en condiciones frías (4 ° C), los mismos animales cambiaron su preferencia al lado estimulado por luz (Fig. 4j-m). Este resultado es consistente con nuestro patrón de actividad dependiente del estado encontrado en estudios anteriores de fotometría de fibra (Fig. 2f, g). Además, dicho cambio de valencia dependiente del estado estaba presente sólo en ratones que expresaban ChR2 y no en los controles de RFP. Los resultados del RTPP sugieren que la transición estatal mediada por Xi para la búsqueda de alimentos durante la CIEC podría estar impulsada por una valencia positiva.

Por último, buscamos caracterizar los tipos de células y los objetivos de proyección de Xi. Primero, utilizando ratones vGLUT2-Cre y vGAT-Cre30,31, encontramos que la búsqueda de alimentos regulada por Xi estaba mediada principalmente por neuronas glutamatérgicas en Xi y no a través de células GABAérgicas (datos ampliados, figuras 9a-l). A continuación, inyectamos virus adenoasociado (AAV) que expresa mCherry para mapear los objetivos de proyección de Xi. De acuerdo con informes anteriores23,24, Xi se proyectó al núcleo accumbens (NAc), la amígdala basolateral (BLA) y la corteza cingulada anterior (ACC) (Fig. 5a, b). Sin embargo, debemos señalar aquí que debido a que Xi es una región pequeña y actualmente no tenemos un marcador genético para las neuronas Xi activadas por CIEC, nuestros estudios de rastreo tienen una limitación con respecto a la orientación de regiones vecinas como PVH y Re. Para confirmar y determinar aún más si una o más de estas proyecciones correspondían a la población XiCIEC, diseñamos un experimento de doble etiquetado en el que se inyectaron individualmente tintes CTB retrógrados en NAc, BLA y ACC. Descubrimos que la mayor superposición entre c-Fos activado por frío y CTB se produjo en las neuronas que proyectan Xi-NAc (Fig. 5d-g), lo que nos llevó a probar el papel de la proyección de Xi-NAc en la alimentación inducida por frío. Inyectamos AAV que expresa ChR2 en el Xi e implantamos una fibra óptica por encima de NAc, BLA o ACC (Fig. 5i, j, arriba y Datos extendidos Fig. 9a). La fotoactivación de la proyección Xi-NAc, pero no de la proyección Xi a ACC o BLA, resultó en un aumento significativo en la ingesta de alimentos (Fig. 5i, j y Datos ampliados Fig. 10a, b). Estos efectos específicos de la proyección se confirmaron aún más utilizando dos implantes de fibra (NAc y BLA) en los mismos animales pero fotoestimulados secuencialmente (Datos ampliados, figuras 10c-g). Finalmente, usando RTPP, también encontramos que la activación de la proyección Xi a NAc resultó en una valencia positiva dependiente del frío, mientras que la activación de otras proyecciones no lo logró (Fig. 5k, l). En conjunto, estos resultados muestran que la proyección Xi-a-NAc media principalmente los comportamientos de búsqueda de alimentos inducidos por el frío.

a,b, Esquema del etiquetado anterógrado de tdTomato (a). A los ratones se les inyectó AAV-CaMKIIa-tdTomato en Xi y se observaron fibras axonales en ACC, BLA y NAc (b) (n = 5 ratones). c – f, Esquema (c) e imágenes de superposición representativas entre señales CTB retrógradas y c-Fos en Xi: ACC-Xi (d), BLA-Xi (e) y Xi-NAc (f). Barras de escala, 200 μm. g, Cuantificación del solapamiento CTB/c-Fos. n = 5 para ACC, n = 6 para BLA y n = 4 para NAc. Los datos son media ± sem ****P < 0,0001 para ACC frente a NAc y ***P = 0,0002 para BLA frente a NAc utilizando ANOVA unidireccional ordinario con la prueba de comparación múltiple de Tukey. h. Esquema de experimentos de optogenética específicos de proyección. i, j, Cuantificación del cambio en la ingesta de alimentos y la actividad física después de la estimulación de la proyección Xi-NAc (i) y Xi-ACC (j) durante CIEC (n = 8 ratones). Los datos son media ± sem **P = 0,0052 para la ingesta de alimentos, NS = 0,9163 para la actividad física para Xi-NAc (i); NS = 0,8037 para la ingesta de alimentos y NS = 0,5893 para la actividad física para Xi-ACC utilizando una prueba t pareada de dos colas (j). k,l, Prueba RTPP específica de proyección. El control RFP se inyectó en Xi y se estimuló en Xi para controlar todas las proyecciones (n = 8 ratones). k, Porcentaje de tiempo dedicado al lado de la estimulación láser. Los datos son media ± sem ****P < 0,0001 para Xi-NAc RT versus Xi-NAc 4 °C, NS = 0,3027 para Xi-ACC RT versus Xi-ACC 4 °C, NS > 0,99 para RFP RT versus RFP 4 °C (n = 8 ratones por grupo). l, Cambio porcentual en la preferencia después de la estimulación, normalizado con respecto a la preferencia de lugar inicial para el mismo animal. Los datos son media ± sem ***P = 0,0003 para Xi-NAc RT versus Xi-NAc 4 °C, NS = 0,6413 para Xi-ACC versus Xi-ACC 4 °C y NS > 0,99 para RFP RT versus RFP 4 °C utilizando ANOVA ordinario de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Tukey (n = 8 ratones por grupo).

Mediante el aprovechamiento de la detección de todo el cerebro, las imágenes de calcio in vivo y las manipulaciones quimio y optogenéticas, demostramos que el núcleo Xi sirve como una región cerebral clave en la promoción de conductas de búsqueda de alimentos inducidas por el frío. Aunque se ha informado ampliamente sobre la alimentación inducida por el frío en todas las especies animales, incluidos los humanos, nuestro estudio sugirió que tal aumento de la alimentación no fue una respuesta directa a la sensación de frío ni un aumento unilateral en los comportamientos de búsqueda de alimentos, sino más bien un resultado dinámico de las prioridades de transición. entre conservación y reposición de energía en respuesta a una elevada deuda calórica en condiciones de frío.

Curiosamente, aunque la actividad de Xi se asoció con transiciones de comportamiento (Fig. 2j), volvió al valor inicial antes de que comenzara la alimentación (Fig. 2f), lo que sugiere que no se requiere una actividad de Xi sostenida para la alimentación. Recientemente se ha demostrado que vMT/Xi activa cambios de comportamiento entre estrategias que reducen y mejoran la prominencia en respuesta a amenazas visuales en ratones25. Con reminiscencias de este cambio, especulamos que la actividad endógena de Xi podría activar transiciones de comportamiento desde la conservación de energía a un estado de reposición (alimentación), porque la activación experimental de Xi aumentó la alimentación asociada a CIEC (Figs. 3g y 4c), potencialmente al reducir el umbral requerido. para aumentar la probabilidad de transiciones de estado 1 a 2 (Fig. 4g – i). Esta activación, sin embargo, es específica del contexto frío en el que coordinar el gasto y la ingesta de energía es fundamental para la supervivencia: parece estar menos involucrado en condiciones de inanición, en las que el impulso de alimentación es más unilateral (Datos ampliados, figura 4). Esta especificidad sugiere que entradas adicionales asociadas a CIEC, como metabolitos, hormonas o señales interoceptivas, que actúan en una o más regiones aguas arriba de Xi, son necesarias para las transiciones de valencia y activación conductual mediadas por Xi. Se requieren más estudios para dilucidar las identidades y mecanismos de estos insumos. En conjunto con toda la evidencia disponible, proponemos que Xi podría representar un mecanismo importante para el cambio dinámico de estrategias de supervivencia opuestas durante comportamientos naturales específicos.

Las conductas alimentarias están estrictamente reguladas por circuitos homeostáticos y de recompensa32,33,34. El Xi es una región del cerebro menos estudiada que no es un componente directo de los clásicos sistemas de recompensa hipotalámicos o límbicos. Sin embargo, se proyecta a múltiples regiones bien conocidas involucradas en la regulación de la alimentación, incluida la corteza prefrontal, BLA y NAc21 (Fig. 5a, b). Descubrimos que los comportamientos de alimentación y cambio de valencia regulados por Xi estaban mediados principalmente por la proyección de Xi a NAc. Como centro de recompensa límbico, se sabe que el NAc integra señales sensoriales y motivacionales para guiar la producción motora35,36 y regular la alimentación37,38. Sobre la base de nuestros hallazgos, proponemos que la NAc es un objetivo clave de Xi en la motivación de los animales para cambiar los estados de comportamiento según lo dicta el estado metabólico interno. Sin embargo, queda por determinar cómo la actividad de Xi interactúa o se integra con otros aspectos del marco de alimentación canónico y, especialmente, cuál es la identidad de sus señales de entrada.

Aunque la alimentación es uno de los comportamientos de los roedores más estudiados, se ha modelado principalmente en el contexto de la restricción alimentaria (por ejemplo, el ayuno nocturno) en la creación de un equilibrio energético negativo. La alimentación inducida por frío proporciona un nuevo paradigma para estudiar el apetito impulsado por el gasto de energía. Aunque tanto la restricción de alimentos como el gasto de energía crean un balance energético negativo neto, la fisiología del organismo puede ser marcadamente diferente; por ejemplo, el ayuno se asocia con niveles más bajos de glucosa, leptina e insulina en sangre y una termogénesis y tasas metabólicas básicas suprimidas, mientras que la adaptación al frío está acompañada de alta utilización de glucosa, termogénesis elevada y tasas metabólicas más altas. La compensación de energía inducida por el frío y los sustratos neuronales asociados (como el Xi y muchos otros que se muestran en la pantalla de todo el cerebro) podrían proporcionar un punto de entrada para comprender el déficit de energía naturalista creado por otros estados de alta EE, como el ejercicio y la lactancia, hallazgos que Será importante no sólo para comprender la biología fundamental de los mamíferos sino también para la obesidad y el control del peso.

Los experimentos con animales se realizaron en el Instituto de Investigación Scripps, La Jolla o en el Centro Médico Beth Israel Deaconess. Los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Scripps o del Centro Médico Beth Israel Deaconess, respectivamente. Los experimentos se realizaron en ratones de 2 a 6 meses de edad. A ratones C57BL/J6 de tipo salvaje se les inyectaron virus entre las 6 y 8 semanas de edad y se les permitió recuperarse durante al menos 1 semana antes de los experimentos o de la habituación relacionada con los experimentos. El tamaño del grupo no se predeterminó basándose en la ley de potencia estadística sino en estudios publicados previamente. Los animales fueron asignados aleatoriamente a diferentes grupos experimentales antes de las inyecciones virales. Se utilizaron machos y hembras para histología y etiquetado de c-Fos. Se utilizaron ratones macho para estudios de comportamiento en movimiento libre.

AAV8-hSyn-DIO-Gq–mCherry (Addgene, no.44361-AAV8), AAV8-hSyn-DIO-Gi–mCherry (Addgene, no. 44362-AAV8), AAV8-hSyn-mCherry (Addgene, no. 114472- AAV8) y AAV9-Syn-GCaMP6m-WPRE-SV40 (Addgene, n.º 100841-AAV9) se obtuvieron de Addgene.

AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST se obtuvo de la UNC, y AAV8-Ef1a-DIO hChR2(H134R)-p2AScarlett y AAV8-CaMKIIa-hChR2-p2A-oScarlet se obtuvieron de Stanford. El anticuerpo c-Fos se adquirió comercialmente (Señalización celular, n.º 2250) al igual que CNO (Hola, n.º HB1807).

Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 3,0% en una cámara de inducción y, después de 5 minutos, las cabezas de los animales se fijaron en un dispositivo estereotáctico (Kopf) utilizando barras para las orejas. Los ratones se mantuvieron bajo 0,8-1,2% de isoflurano durante la cirugía en una almohadilla térmica tibia (la temperatura corporal se mantuvo a 36 °C). Se afeitaron las cabezas para eliminar el pelo y, utilizando una hoja de bisturí, se hizo una incisión en la línea media para exponer el cráneo. La cabeza se equilibró mediante un sistema bregma y lambda en la posición de cabeza estereotáxica. Utilizando taladros dentales, se realizaron pequeñas craneotomías sobre el lugar de la inyección. El virus se infundió a 75 nl min-1 utilizando un inyector Nanoject II (Drummond) conectado a una jeringa Hamilton de 10 μl. La aguja se mantuvo en el lugar de la inyección durante 10 minutos antes de retirarla. Se permitió que los ratones se recuperaran durante 1 a 2 semanas antes de los experimentos o de la habituación relacionada con los experimentos.

Para la estimulación quimiogenética, se entregó un cóctel de 125–150 nl de AAV8-hSyn-DIO-Gq–mCherry o AAV8-hSyn-mCherry y AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST a la región vMT/Xi (bregma, −1,0 mm; línea media, 0 mm; superficie dorsal, −4,4 mm). La concentración final de virus ESARE en el cóctel fue de 7 × 1012 copias genómicas ml–1. Dos semanas después de la cirugía, los ratones se habituaron a la inyección de tamoxifan (etiquetado con vCAPTURE de neuronas asociadas a XiCIEC).

Para experimentos de optogenética con activación no selectiva de toda la región vMT/Xi (bregma, −1,0 mm; línea media, 0 mm; superficie dorsal, −4,4 mm), 150 nl de AAV8-CaMKIIa-hChR2-p2A-oScarlet (5 × Se inyectaron 1012 copias genómicas ml–1) en la región vMT/Xi. Después de retirar la aguja, se implantó una cánula de fibra óptica (200 μm de diámetro, apertura numérica (NA) de 0,22, RWD Life Science) en el vMT/XI, 100–200 μm dorsal al sitio de inyección (bregma, −1,0 mm; línea media , 0 mm; superficie dorsal, −4,2 a −4,3 mm). La cánula óptica se cementó al cráneo con cemento dental. Para la cohorte de etiquetado de optogenética dependiente de la actividad, se inyectaron 200 nl de un cóctel de AAV8-Ef1a-DIO hChR2(H134R)-p2AScarlett + AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST (7 × 1012 copias genómicas ml-1) en la región vMT/Xi.

Para experimentos de fotometría de fibra, se inyectaron 150–180 nl de virus AAV9-Syn-GCaMP6m-WPRE-SV40 (7 × 1012 copias genómicas ml–1) mediante cirugía estereotáxica en la región vMT/Xi (bregma, −1,0 mm; línea media, 0 mm; superficie dorsal, −4,4 mm) y se implantó una cánula de fibra óptica (400 μm de diámetro, 0,5 NA, RWD Life Science) (bregma, −0,9 mm; línea media, 0 mm; superficie dorsal, −4,2 mm). Tanto para la optogenética como para la fotometría de fibra, solo se implantó una cánula de fibra óptica única porque Xi es una estructura de línea media.

Para la exposición al frío se utilizó una incubadora de roedores con temperatura controlada (n.º RIS28SSD, Powers Scientific), mantenida a 4 °C. Para las condiciones de termoneutralidad se utilizó una habitación cálida con temperatura controlada fijada a 30 °C. Para todos los experimentos de exposición a la temperatura, todos los ratones se alojaron individualmente con una pequeña cantidad de materiales de cama para garantizar que cada individuo recibiera la misma exposición a la temperatura. Para la exposición al frío, los animales se transfirieron directamente a la incubadora a 4 °C en una jaula sin tapa para facilitar el equilibrio de temperatura. Los ratones tuvieron libre acceso a comida y agua durante la mayoría de los experimentos de exposición al frío y al calor, excepto en la condición CIEC+ y durante los experimentos quimiogenéticos inhibidores, en los que se les restringió el alimento durante varios períodos de tiempo, como se indica en las figuras individuales.

Se permitió que los ratones se recuperaran durante 7 días después de la cirugía de implante optogenético para el experimento de optogenética no selectiva, o durante 14 días después de la inyección de tamoxifeno para la cohorte de ratones vCAPTURE. Se entrenaron ratones optogenéticos y se los habituó a los gránulos (gránulos de 20 mg, no. F0071, Bioserv) junto con el sistema dispensador de gránulos FED2 (ref. 39) en su jaula doméstica durante 5 días, antes de que se les proporcionara libre acceso a los gránulos de alimento durante 4 días. días para evitar el desarrollo de un valor hedónico en los gránulos de alimento. Los ratones se habituaron aún más a las cámaras de comportamiento durante 5 días con bolitas de comida y FED2 antes del primer experimento. Todos los experimentos de ingesta de alimentos se realizaron entre las 08:00 y las 15:00 para evitar la influencia del ciclo circadiano natural en el comportamiento alimentario.

Para los experimentos de optogenética, se conectaron ratones experimentales a un láser de luz azul (473 nm) con una fibra óptica (200 μm de diámetro, 0,22 NA, RWD Life Science). La luz se entregó en pulsos de 10 ms a 20 Hz, 3 s encendido/2 s apagado, durante 10 min. La potencia luminosa en la punta de la fibra fue de 10 mW. Para los experimentos de quimiogenética, se utilizó una pastilla de comida normal para medir la ingesta de alimentos en peso para aumentar el rendimiento. La solución madre de CNO se preparó recién disolviéndola en DMSO y luego se diluyó en solución salina; a los ratones se les inyectaron 3 mg kg–1 de CNO para la activación de la cohorte Gq y 5 mg kg–1 para la cohorte inhibidora de Gi. Los ratones de control recibieron la misma cantidad de CNO que la cohorte experimental.

Se registraron datos de la jaula metabólica de 24 ratones alojados individualmente, colocados en un calorímetro indirecto Promethion (Sable Systems) con un gabinete con temperatura controlada (Pol-Eko) y provistos de alimento ad libitum (Labdiet 5008, 3,56 kcal g–1) y agua purificada. por ósmosis inversa. Los ratones se mantuvieron bajo fotoperiodos de luz/oscuridad de 12/12 h (06:00–18:00) a una temperatura ambiente de 23 ± 0,2 °C. Las transiciones de temperatura de 23 a 4 °C se realizaron durante 3 h, comenzando a las 06:00. Los datos se exportaron con Macro Interpreter, macro 13 (Sable Systems) antes del análisis en CalR v.1.3 (ref. 40). Las tasas de gasto energético se calcularon utilizando la ecuación de Weir41. Se analizaron dos conjuntos de datos. Conjunto de datos 1: 24 ratones se mantuvieron a 23 °C durante 2,5 días (62 h). Se mantuvo una temperatura ambiente de 4 °C durante 9 h adicionales antes de volver a 23 °C durante 16 h. Conjunto de datos 2: 11 ratones se mantuvieron a 23 °C durante 5 días (115 h) seguidos de 4 °C durante 5 días más (118 h) (Datos ampliados, figuras 1c-e).

Para etiquetar las neuronas asociadas a CIEC en la región vMT/XI con la activación de Gq-DREADD, los ratones recibieron una inyección estereotáxica de un cóctel viral con ESARE-ER-Cre-ER + DIO-Gq y se habituaron a la configuración todos los días durante 2 a 3 h durante 1 semana. Los ratones ESARE-ER-Cre-ER/Gq se dividieron aleatoriamente en grupos XiCIEC y Xinon-CIEC. El día del etiquetado, el grupo de ratones XiCIEC se colocó en condiciones de frío durante 6 h con comida y agua ad libitum. Los ratones recibieron 20 mg kg –1 de 4-TM (Sigma, no. H6278) mediante inyección intraperitoneal 6 h después de haberlos colocado en condiciones de frío. Cuando estos ratones ingresan a CIEC, las neuronas vMT/Xi que están activas durante CIEC inducen FOS y CreERT2. Después de la inyección de 4-TM, CreERT2 recombinará selectivamente el Gq-DREADD dependiente de Cre que codifica AAV8-hSyn-DIO-Gq-mCherry en la célula que expresaba FOS. Esta recombinación conduce a la expresión permanente de Gq-DREADD en esas células, que luego puede activarse selectivamente en un momento posterior mediante la administración del agonista DREADD CNO. Después de las inyecciones de 4-TM, estos ratones se mantuvieron en condiciones de frío durante 2 h más antes de regresarlos a su jaula y mantenerlos a 23 °C. Como control, generamos una cohorte adicional de ratones que recibieron una inyección estereotáxica del mismo cóctel viral que XiCIEC y se habituaron usando el mismo protocolo excepto que, el día del etiquetado, recibieron 20 mg kg-1 de inyección de 4-TM. después de mantenerse a 30 °C durante 6 h en lugar de mantenerse en condiciones de frío. Los datos de c-Fos en la Fig. 1 muestran que muy pocas células estaban activas en la región vMT/Xi mientras los ratones estaban en condiciones termoneutrales durante 6 h en comparación con el escenario en condiciones frías. A esta cohorte de ratones la denominamos Xinon-CIEC. Ambos grupos de ratones fueron inyectados a la misma hora del día para evitar la variabilidad del etiquetado asociada con el ritmo circadiano. Se siguió un protocolo similar para los ratones optogenéticos que recibieron una inyección estereotáxica de un cóctel viral de AAV5-ESARE-ER-Cre-ER-PEST y AAV8-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-p2AScarlett.

Los ratones fueron anestesiados con isoflurano antes de la perfusión transcardial con PBS helado, seguido de paraformaldehído (PFA) al 4% frío. Los cerebros se extrajeron y se fijaron durante la noche con PFA al 4% a 4 °C. Al día siguiente, los cerebros fijados se sumergieron en agarosa al 3% y se mantuvieron en condiciones de frío durante 2 h para su inclusión. Los cerebros se cortaron en un vibratomo (Leica VT1000S) en secciones coronales de 80 μm y se recogieron como dos conjuntos iguales en una placa de seis pocillos llena de PBS. Para la permeabilización por tinción inmunohistoquímica, las secciones de cerebro se incubaron con un tampón de bloqueo que contenía PBS, TritonX-100 al 0,3% (PBST) y suero de burro al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación suave. Después de la permeabilización, las secciones de cerebro se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C en un tampón de bloqueo durante 16 h. A continuación, las rodajas de cerebro se lavaron tres veces con PBST durante 20 minutos cada una para eliminar el anticuerpo primario no unido y luego se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente diluidos en tampón de bloqueo. Finalmente, las rodajas de cerebro se lavaron nuevamente con PBST tres veces, 20 minutos cada una, para eliminar el anticuerpo secundario no unido antes de montarlas en portaobjetos de vidrio Super-Frost Plus (VWR). Se tomaron imágenes de cortes de cerebro utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con objetivo × 10, apertura numérica de 0,6 e inmersión en agua (XLUMPlanFI, Olympus). Se tomaron imágenes de cada corte de cerebro en una pila Z de 10 μm. La cuantificación de c-Fos se realizó para un solo plano (números mm–2). Para la cuantificación de c-Fos vCAPTURE con doble etiquetado, se contaron las células en una región de interés definida manualmente siguiendo puntos de referencia anatómicos. Los anticuerpos utilizados para histología son: anticuerpo c-Fos (Señalización celular, n.° 2250, diluido 1:400), anti-conejo-488 (Jackson Immuno Research, n.° 711-546-152, diluido 1:400).

Se habituaron ratones C57BL/J6 de tipo salvaje a la configuración de comportamiento durante 5 días antes del experimento real. El día del experimento, los ratones alojados individualmente se mantuvieron en condiciones frías (4 °C) o termoneutrales (30 °C) durante 6 h con libre acceso a alimentos y agua antes de la perfusión. Los cerebros se recogieron y se fijaron durante la noche en PFA al 4%. LifeCanvas Technologies realizó la limpieza de todo el cerebro, las imágenes y el análisis automatizado a través de un servicio contratado. En resumen, se prepararon cerebros completos fijados con SHIELD (estabilización en condiciones duras mediante enlaces epóxido intramoleculares para evitar la degradación) para preservar la antigenicidad de las proteínas antes de eliminarlos activamente e inmunomarcarlos con un anticuerpo c-Fos usando SmartBatch+. Los cerebros etiquetados fueron comparados con índices mediante EasyIndex y se tomaron imágenes mediante microscopía volumétrica de lámina luminosa (SmartSPIM), seguido de posprocesamiento de imágenes, cuantificación celular, registro de atlas y gráficos regionales. El número promedio de células c-Fos+ en cada región se agruparon en siete "cubos" basados ​​en anotaciones ABA para la visualización de datos. El tamaño de los puntos representa las diferencias medias entre condiciones de 30 y 4 °C en cada región.

Los ratones se conectaron a un parche de fibra (núcleo de 400 μm, NA 0,5, RWD) conectado a fuentes de luz de 470 y 410 nm. La fotometría de fibra y la configuración de adquisición se han descrito previamente25. La luz de excitación de 470 nm se usó para medir la señal de Ca2+ y la luz de excitación de 410 nm como señal de referencia. Los cambios en la señal de fluorescencia de Ca2+ (470 nm) se compararon con la fluorescencia de Ca2+ de fondo (410 nm), proporcionando un control interno para el movimiento y el blanqueo de la señal. Se utilizó una cámara científica complementaria de semiconductores de óxido metálico (Hamamatsu, Orca Flash 4.0 v.2) para capturar las imágenes de los extremos del cable de conexión, y estas se procesaron utilizando un código MATLAB descrito previamente25. Se utilizó hardware de adquisición de datos (National Instruments, NI PCIe-6343-X) para digitalizar imágenes a 5 kHz. Las señales se expresaron en dF/F, donde F representa la fluorescencia inicial. Se utilizó la grabación en vídeo del comportamiento para anotar manualmente y marcar la hora de la alimentación y otros comportamientos. El AUC y los valores máximos se calcularon para −20/−10 a 10 s desde el evento definido (para los estados de alimentación y HMM, respectivamente).

Para los experimentos de ayuno-realimentación, los ratones estuvieron en ayunas durante 16 h. Los ratones se colocaron en una cámara alta y su cánula se conectó a la configuración de fotometría de fibra. Se permitió que los ratones se habituaran durante 30 minutos y se colocó un dispositivo de alimentación (FED3) en una esquina de la cámara. FED3 fue programado para comenzar a dispersar los gránulos 15 minutos después de colocar el dispositivo en la cámara para evitar la introducción de ruido en el experimento. La adquisición, análisis y procesamiento de datos se llevaron a cabo como se describe anteriormente.

Veinte ratones se dividieron en cinco grupos: 1 (2 h, frío), 2 (4 h, frío), 3 (2 h, termoneutral), 4 (4 h, termoneutral) y 5 (jaula casera, 0 h). La cuantificación de la medición del plasma sanguíneo se realizó de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes: kit ELISA de leptina de ratón (Crystal Chem, no. 90030), kit de cuantificación de ácidos grasos libres (abcam, no. ab65341) y kit de ensayo de glicerol libre (abcam, no. ab65337 ).

Se habituaron ratones C57BL/6 de tipo salvaje a la configuración (usando FED2) durante 4 días antes de registrar sus comportamientos a 4 °C. Para cada ratón se grabaron dos vídeos, uno desde la vista superior y otro desde el lateral, utilizando dos cámaras web Logitech C270 independientes. Anotamos manualmente el inicio y el final de cada comportamiento. Los analizadores no conocían los grupos experimentales de ratones. Los comportamientos incluían sentarse, temblar, arreglarse la cabeza, girar, arreglar la parte inferior del cuerpo, salir, comer, retroceder, empujar la ropa de cama, ponerse de pie, recuperar la ropa de cama, beber, cavar, arreglarse la cola y caminar. Los comportamientos se anotaron cada 1 s. HMM requiere una secuencia de entrada, una matriz de transición estimada y una matriz de emisión estimada. La secuencia de entrada se generó con datos de videos de 180 minutos, previamente analizados manualmente, de ratones expuestos a condiciones de frío durante 4 a 6 h con libre acceso a comida y agua. La secuencia de entrada de cada ratón se puso en un vector. Definimos un HMM de tres estados: (1) estado de conservación de energía, (2) exploración con consumo de alimentos y (3) exploración sin consumo de alimentos. Generamos la estimación inicial para la matriz de transición estimada asumiendo probabilidades iguales para todas las transiciones, porque no teníamos información a priori. Generamos la estimación inicial para la matriz de emisiones estimada prediciendo la probabilidad de comportamiento en cada estado. Utilizamos un código MATLAB personalizado utilizando el algoritmo Baum-Welch para adquirir matrices de transición y emisión. Para calcular el estado subyacente de comportamiento basado en una secuencia de comportamientos, utilizamos la función incorporada hmmviterbi de MATLAB.

Para las mediciones basales de preferencia de lugar de ratones optogenéticos dependientes de la actividad, se colocaron ratones ChR2-XiCIEC o RFP-XiCIEC en una caja acrílica de dos cámaras (60 × 25 × 30 cm3), con cada lado de la cámara midiendo 30 × 25 cm2), a temperatura ambiente (23 °C). Cada cámara tenía diferentes patrones contextuales en la pared: un lado tenía un patrón de rayas blancas y negras y el otro un patrón de puntos. Los movimientos del mouse se registraron con una cámara web Logitech de vista superior durante toda la sesión de 30 minutos. Los ratones se habituaron durante varias horas diarias con un cable de fibra óptica conectado a sus implantes de cabeza durante 1 semana en una cámara alta antes de la preferencia de lugar basal. Los videos se cuantificaron manualmente según la cantidad de tiempo pasado en cada cámara. Para medir RTPP a temperatura ambiente, los ratones se colocaron en el centro de la cámara de preferencia de lugar y el láser se encendió cuando las cuatro patas del ratón estaban en la cámara de estimulación. El láser fue encendido y apagado manualmente (10 mW, 10 ms, 20 Hz) por el operador sentado en la habitación contigua mientras monitoreaba un video en vivo del mouse. El láser se mantuvo encendido mientras los ratones permanecían en la cámara de estimulación y se apagó cuando salieron. Para probar el cambio en la valencia mientras los ratones se sometían a CIEC, se mantuvieron a 4 ° C durante 5 a 6 h con acceso a comida y agua ad libitum antes de realizar RTPP en condiciones de frío. A los ratones se les dio un intervalo de 1 semana entre RTPP a 23 y 4 °C.

Para medir el comportamiento similar a la ansiedad en la cohorte de optogenética, se colocaron ratones en la zona exterior de una arena de campo abierto, acrílica, de paredes blancas (60 × 60 cm2) y se registró el movimiento durante 20 minutos utilizando una cámara web Logitech de vista superior. cámara. Un operador sentado en la habitación contigua mientras monitoreaba una transmisión de video en vivo encendía y apagaba el láser de forma intermitente durante un período de 3 minutos. El tiempo total y la distancia en el 40% central del área se analizaron utilizando un software de seguimiento automatizado personalizado. La prueba en campo abierto se realizó sólo una vez para cada ratón. Los ratones fueron devueltos a su jaula después de la sesión.

Se utilizó ANOVA de dos vías para evaluar cómo el comportamiento se vio afectado por otros factores (por ejemplo, RTPP probado mediante manipulaciones optogenéticas y temperatura). Se utilizó la prueba t no pareada para las comparaciones entre dos grupos. Se utilizaron pruebas de dos colas en todo momento, con α = 0,05. En la leyenda de cada figura se incluyen múltiples ajustes de comparación, réplicas biológicas y definiciones de significado.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos numéricos se incluyen en Información complementaria. Todos los demás datos son demasiado grandes para depositarlos en un repositorio público, pero están disponibles a través del autor correspondiente.

Se puede acceder al código utilizado en este estudio en Zenodo, https://doi.org/10.5281/zenodo.7869467.

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Agradecemos a J. Read, A. Brashears y A. Kanow por su asistencia técnica; H. Wang, H. Zhu y E. Zorrilla por la configuración conductual inicial; Y. Wang por las ilustraciones; Departamento de Investigación de Recursos Animales de Scripps para recursos animales; y miembros del laboratorio Ye para discusiones. Agradecemos a L. Stowers, C. Kim, V. Augustine y W. Hong por sus comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos a AV Kravitz por las aplicaciones de FED3 y a H. Bito por el plásmido ESARE. NKL contó con el apoyo de la beca posdoctoral de la AHA (20POST35200001), el premio Dorris Scholar y la beca posdoctoral Eric y Wendy Schmidt AI in Science. PL contó con el apoyo de Schmidt Science Fellowship y Eric y Wendy Schmidt AI in Science Postdoctoral Fellowship. TQ, ZP y DY contaron con el apoyo del Dorris Scholar Award. LY cuenta con el apoyo del Premio al Nuevo Innovador del Director de los Institutos Nacionales de Salud (n.º DP2DK128800), NIDDK (n.º DK114165, DK134609 y DK124731), BRAIN Initiative/NIMH (n.º MH132570), la Fundación Dana, la Fundación Whitehall, la Fundación Baxter Fundación y la Fundación Abide-Vividion. ASB cuenta con el respaldo de los premios núms. DK133948, DK107717 y OD028635.

Departamento de Neurociencia, Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA, EE. UU.

Neeraj K. Lal, Samarth Aggarwal, Alan Zhang, Kristina Wang, Tianbo Qi, Zhengyuan Pang, Dong Yang, Victoria Nudell y Li Ye

Departamento de Medicina Celular y Molecular, Universidad de California en San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Phuong Le y Gene W. Yeo

División de Endocrinología, Diabetes y Metabolismo, Centro Médico Beth Israel Deaconess, Boston, MA, EE. UU.

Alejandro S. Bancos

Departamento de Medicina Molecular, Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA, EE. UU.

Li Ye

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La conceptualización fue realizada por NKL y LY La investigación y el análisis fueron realizados por NKL, PL, SA, AZ, KW, TQ, ZP, DY, VN y ASB La calorimetría indirecta fue realizada por ASB Modelado y el análisis computacional fue realizado por PL y GWY Funding la adquisición fue responsabilidad de LY La administración del proyecto estuvo a cargo de LY La supervisión estuvo a cargo de LY, GWY y ASB La redacción del borrador original estuvo a cargo de NKL y LY Todos los autores contribuyeron a la redacción, revisión y edición.

Correspondencia a Li Ye.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Qingchun Tong y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a – b, Gráficos de barras que muestran la ingesta promedio de alimentos (n = 24 ratones) (a) y el gasto de energía (n = 24 ratones) (b) para los datos presentados en la Fig. 1a – cc Esquema que representa el protocolo de exposición al frío a largo plazo. 5 días (115 h) después de estar a temperatura ambiente (23 °C), la temperatura se cambió a 4 °C. blanco: fase clara, gris: fase oscura. Los datos son media ± SEM. ****P < 0,0001 utilizando la prueba t pareada de dos colas. d – e, Cuantificación de la ingesta de alimentos (n = 24 ratones) (d) y el gasto de energía (n = 24 ratones) (e) durante las fases de luz y oscuridad antes y después del cambio de temperatura. Para calcular la ingesta promedio de alimentos y el gasto energético, se utilizaron valores de 4 días o 4 noches tanto para RT como para 4 °C (excluyendo el día del cambio de temperatura). Los datos son media ± SEM. ****P < 0,0001 utilizando una prueba t pareada de dos colas. f, Niveles de glucosa en sangre de ratones WT a las 2 h y 4 h después de la exposición al frío (los puntos de tiempo son de los mismos animales) (n = 8 ratones). Los datos son media ± SEM. **P = 0,001 para la comparación entre 0 h y 2 h 4 °C, **P = 0,0028 para 0 h frente a 4 h 4 C, utilizando un ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunnett.

a, Utilizando 15 etiquetas diferentes de acciones tomadas por ratones en el paradigma CIEC, un HMM estimó la matriz de emisión con tres estados (conservación de energía (estado 1), exploración con búsqueda y consumo de alimentos (estado 2) y exploración sin alimentos. buscando (estado 3)). (n = 3 ratones). b, Probabilidades de la matriz de transición correspondiente entre cada estado. c, Matriz de transición de diferentes acciones realizadas por el mouse durante el estado CIEC.

a – g, se recolectaron cerebros de ratones sometidos a CIEC (6 h a 4 ° C frío) o no CIEC (6 h a 30 ° C termoneutral). n = 4 animales por grupo. Imágenes de todo el cerebro y datos de mapeo de cFos para todo el cerebro en a y regiones individuales de la corteza cerebral en b, núcleos cerebrales c, hipotálamo d, mesencéfalo e, rombencéfalo f y cerebelo g. Cada punto representa una región del cerebro anotada según el Allen Brain Atlas. El tamaño de los puntos representa las diferencias medias entre las condiciones cálidas y frías en cada región. Véase también la tabla complementaria 1 para todas las regiones. Véase también la Tabla complementaria 1.

a, cuantificación de cfos de la región Re de la figura principal 2b. (n = 4 ratones para cada condición). Los datos son media ± SEM. ns, no significativo utilizando ANOVA ordinario unidireccional con prueba de comparación múltiple de Dunnet. b, imágenes representativas de MnPO (en Bregma 0.14) para el mismo experimento como se muestra en la figura principal 2a-c. c, Imágenes representativas de Xi de ratones después de 7 días de exposición al frío (n = 4 para RT y frío). d, Imágenes representativas de Xi c-Fos de ratones hembra después de 5 h de exposición al frío. (n = 2 para RT, n = 3 para frío). Barra de escala: 200 μm. e, señal de calcio promedio de las neuronas Xi mientras la temperatura ambiente descendía de 23 °C a 4 °C. (promediado de n = 3 ratones). f – g, señal de calcio Xi para ratones sometidos a CIEC o a un estado CIEC+ (4 °C sin alimento durante 3 horas para generar una compensación de energía inducida por el frío exacerbada), la línea roja punteada indica un solo episodio de alimentación. (n = 4 ratones). La línea continua es el promedio y el área sombreada es SEM. h, Cuantificación de AUC delta F/F y pico delta F/F. Los datos son media ± SEM. ****P < 0,0001, **P = 0,01 utilizando la prueba t no apareada de dos colas. (n = 4 ratones) i, señal de calcio promediada de las neuronas Xi de un ratón sometido a CIEC, promediada de 11 eventos de 3 ratones diferentes. La línea continua es el promedio y el área sombreada es SEM. La línea de puntos roja es el punto de tiempo de transición de estado calculado utilizando HMM. j – k, Señal de fotometría de fibra de AAV-GCaMP6m que expresa neuronas vMT/Xi después de un ayuno nocturno durante la realimentación a temperatura ambiente (j) o a 30 °C (k), mostrada como el promedio de 35 eventos de 5 ratones diferentes para (j ) y 31 eventos de 5 ratones diferentes para (k). La línea continua es el promedio y el área sombreada es SEM. l, Gráfico de barras que muestra el área bajo la curva (AUC) dF/F (−20 s a 10 s) para j,k y la figura principal 2f, g. Los datos son media ± SEM. ****P < 0,0001, ns = 0,8572 para comparar entre alimentación a 30 °C y realimentación en ayunas a 30 °C, ns = 0,1678 para comparación entre alimentación a 30 °C y realimentación en ayunas a 23 °C usando un método unidireccional ANOVA con prueba de comparación múltiple de Dunnett.

a – b, Cuantificación de los niveles circulantes de leptina en ratones después de estar en frío (a) o a 30 °C (termoneutral) (b) durante un período de tiempo determinado (n = 4 ratones). c – f, Cuantificación de glicerol plasmático (cyd) y ácidos grasos libres (e y f) para ratones en frío o a 30 °C (termoneutral) (n = 4 ratones). Los datos son media ± SEM. *P = 0,0143 para FFA en frío usando un ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunnett.

a, Sección de histología esquemática y representativa del ratón vCAPTURE DREADD Gi. Barra de escala: 500 μm. b, Ingesta de alimentos para Xi Gq vCAPTURED en frío activado a 23 °C (n = 5 para RFP y Gq). c, Datos de ingesta de alimentos para Xi Gi vCAPTURED en frío a 23 °C (n = 4 para RFP y n = 8 para Gi). Los datos son media ± SEM. ns > 0,99 para Gq, ns = 0,9163 para Gi ingesta de alimentos a 23 °C utilizando la prueba t no apareada de dos colas.

a, Sección histológica esquemática y representativa de un ratón inyectado con constitutivo (hSyn-ChR2) en Xi. Barra de escala: 500 μm. b, Diseño experimental para probar el efecto de la activación masiva de Xi y las neuronas circundantes en la alimentación asociada a CIEC. c – e, ingesta de alimentos antes y después de la estimulación (n = 8 ratones, N = 16 veces) (c) y d – e actividad física (medida como distancia total recorrida) antes y después de la estimulación (d) (n = 8 ratones) y rastros individuales de movimiento físico de un solo animal (e). Los datos son media ± SEM. ****P < 0,0001 y *P = 0,0184 utilizando la prueba t pareada de dos colas. f, Ingesta de alimentos y actividad física de animales que expresan ChR2 constitutivo en Xi a RT (n = 8 animales) Los datos son media ± SEM. ****P < 0,0001, **P = 0,0096 utilizando la prueba t pareada de dos colas.

a, Esquema de la prueba en campo abierto. b – d, Cuantificación del tiempo pasado afuera (b) o del tiempo pasado adentro (c) (o la proporción del mismo (d) luego de la activación de neuronas XiCIEC vCAPTUREd en ratones control ChR2 o RFP (n = 11 para ChR2 y n = 6 para RFP). Los datos son media ± SEM. ns = 0,6087 para (b) y (c), ns = 0,5380 para (d) usando la prueba t no pareada de dos colas. e–f, Gráfico de barras que muestra la diferencia en la ingesta de alimentos en condiciones termoneutrales. Estimulación láser previa y posterior a la temperatura para ratones ChR2 en e (n = 11) y ratones RFP en f (n = 11). Los datos son media ± SEM. ns = 0,1501 para e y ns = 0,4650 para f usando pares de dos colas Prueba t. g–h, ingesta de alimentos (g) y actividad física (h) para ratones XiCIEC vCAPTURED estimulados a temperatura ambiente (n = 11 ratones). Los datos son media ± SEM. ns = 0,1530 para g y ns = 0,7614 para h usando prueba t pareada de dos colas i, probabilidad de estado continuo calculada para el ratón ChR2, preestimulación (fondo blanco) o postestimulación (fondo azul) mientras se somete a CIEC (n = 7 ratones).

a, Histología esquemática y representativa que muestra la inyección de un AAV-DIO-ChR2 viral y un implante optogenético en Xi (la línea blanca continua indica el recorrido de la fibra) en animales vGLUT2. Barra de escala: 500 μm. b – c, ingesta de alimentos en frío antes y después de la estimulación para ratones vGLUT2-ChR2 (b) (n = 8 ratones) y para ratones control vGLUT2-RFP (c) (n = 8 ratones). de, ingesta de alimentos para ratones vGLUT2-ChR2 (d) y ratones vGLUT2-RFP (e) antes y después de la estimulación en condiciones termoneutrales. f, Esquema e histología de animales vGAT2. Barra de escala: 500 μm. g – j, ingesta de alimentos en frío antes y después de la estimulación (g – h) y en condiciones termoneutrales (ij). Los datos son media ± SEM para bj. ***P = 0,009 para b, ns = 0,7849 para c, ns = 0,4869 para d, ns = 0,8018 para e, ns = 0,6682 para g, ns = 0,8383 para h, ns = 0,5490 para i, ns = 0,47 para j mediante prueba t pareada de dos colas. k, Esquema de la configuración de fotometría de fibra para el registro de vGLUT2-Xi inyectado con Dio-GCamp6m en Xi en animales vGLUT2. l, Señal de fotometría de fibra de AAV-Dio-GCaMP6m que se expresa en neuronas vGLUT2-Xi en frío, mostrada como el promedio de 15 eventos de 4 ratones diferentes. La línea continua es el promedio y el área sombreada es SEM.

a, Esquema de la inyección viral de AAV-ChR2 en Xi y el implante optogenético sobre BLA en animales WT. b, Ingesta de alimentos y actividad física en estimulación láser previa y posterior al frío para ratones Xi-BLA (n = 8 ratones). Los datos son media ± SEM, ns = no significativo utilizando la prueba t pareada de dos colas. c, Esquema de la inyección de AAV-ChR2 en Xi y el implante optogenético encima de BLA y NAc en el mismo animal. d – e, línea de tiempo (d) y datos de ingesta de alimentos (e) para el experimento en el que se estimuló primero el BLA y luego el NAc. La ingesta de alimentos se representa para la preestimulación, la postestimulación para BLA y la postestimulación para NAc. f – g, línea de tiempo (f) y datos de ingesta de alimentos (g) para el experimento en el que se estimuló la NAc antes que la BLA. Los datos son media ± SEM. **P = 0,0063, ns = 0,8083 para e, **P = 0,0028, ns = 0,7924 para g usando un ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunnett.

Cuantificación de c-Fos en todo el cerebro de condiciones frías versus termoneutrales.

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Lal, NK, Le, P., Aggarwal, S. et al. El núcleo xifoides del tálamo de la línea media controla la búsqueda de alimentos inducida por el frío. Naturaleza (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06430-9

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Recibido: 11 de agosto de 2022

Aceptado: 12 de julio de 2023

Publicado: 16 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06430-9

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